Do You Miss Me？

豆豆写于19.10.8 
好多天不推了，这些天都是花花在忙活，好啦，又回归了！
前几天单细胞天地推送了一篇整合scRNA数据的文章：使用seurat3的merge功能整合8个10X单细胞转录组样本
这次根据推送的知识，再结合自己的理解写一写

前言

单细胞数据未来会朝着多样本发展，因此数据整合是一项必备技能。cellranger中自带了aggr的整合功能，而这篇文章（Differentiation dynamics of mammary epithelial cells revealed by single-cell RNA-sequencing）的作者也正是这么做得到的组合后的表达矩阵，然后用Read10X读入

关于文章

这是发表在2017年10月的NC文章。

作者的论点是：乳腺上皮细胞对研究乳腺癌的发展很重要，但目前只有很少的marker可以追踪这群细胞，因此有必要探索乳腺发育不同阶段的乳腺上皮细胞变化。

实验涉及了四个时期：8 weeks virgin =》nulliparous (NP) 未怀孕时期、14.5d gestation (G) 妊娠期第14.5天、6d lactation (L)  哺乳期第6天、11d post involution (PI)  完全退化第11天。其中每个时期都采集两只老鼠的组织细胞，所以一共8个样本，然后使用10X建库，那么最后的测序文件就是8*3 = 24个

如果要对这24个文件分别去整合，使用seurat的merge函数即可，不过问题的关键是：如何用代码将这些样本区分开，然后分别构建对象，最后merge这些对象

开始操作

第一步：准备原始测序数据

我们下载第一个：
GSE106273_RAW.tar (183.5Mb) 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/download/?acc=GSE106273&format=file

感觉手机下载速度就是比电脑快，这个文件在手机上下载3分钟，电脑预计时间1小时

下载后解压，整个过程直接在Rstudio中的Terminal直接完成

第二步：整理数据

思路：根据中间的分组信息（NP、G）将包含的文件放到相应的文件夹中

方法一：shell脚本

# 将同一组数据放在同一目录下
ls GSM* | awk -F '_' '{print $2"_"$3}'| uniq | while read i;do mkdir $i;mv *$i*gz $i;done
# 各自重命名
find -name "*barcodes.tsv.gz" | while read i;do mv $i $(dirname $i)/barcodes.tsv.gz;done
find -name "*genes.tsv.gz" | while read i;do mv $i $(dirname $i)/genes.tsv.gz;done
find -name "*matrix.mtx.gz" | while read i;do mv $i $(dirname $i)/matrix.mtx.gz;done

方法二：R脚本

# 列出当前目录下所有开头是GSM的文件
fs=list.files('./','^GSM')
# 然后获取四个样本信息
library(stringr)
samples=str_split(fs,'_',simplify = T)[,1]
# 设置一个循环，对每个样本信息做同样的事：
#（1）找到包含这个样本的文件(用grepl)
# (2)设置对应的目录名（str_split+paste）然后创建目录（用dir.create）
# (3)将文件放到对应目录(采用的是file.rename)并重命名文件
lapply(unique(samples),function(x){
  y=fs[grepl(x,fs)]
  folder=paste(str_split(y[1],'_',simplify = T)[,2:3],
               collapse = '')
  dir.create(folder,recursive = T)
  file.rename(y[1],file.path(folder,"barcodes.tsv.gz"))
  file.rename(y[2],file.path(folder,"genes.tsv.gz"))
  file.rename(y[3],file.path(folder,"matrix.mtx.gz"))
})

需要注意的是，Read10X函数需要读取解压后的文件，于是还要对所有的数据文件进行解压

find ./ -name "*gz" |xargs  gunzip

常见错误：

• 说找不到Barcode文件，但明明存在Barcode：

  Error in Read10X() : Barcode file missing
  

  那很有可能是因为三个10X数据的命名出了问题，一定要命名成"barcodes.tsv" "genes.tsv""matrix.mtx"   这是V2的说法【在cellranger的V3版本中，genes.tsv叫做features.tsv】

• 说找不到基因文件，那么就要看看测序数据是不是解压后的

  Error in Read10X() : Gene name or features file missing
  

第三步：批量读取成10X对象

Read10X() + CreateSeuratObject()

# 因为Read10X函数需要对目录进行操作，所以先把目录名提取出来
folders=list.files('./',pattern='[12]$')
> folders
[1] "G_1"  "G_2"  "L_1"  "L_2" 
[5] "NP_1" "NP_2" "PI_1" "PI_2"

# 然后使用lapply进行循环(看下lapply的帮助文档就知道，它是对列表或向量进行循环，而apply是对数据框或矩阵操作)
library(Seurat)
sceList = lapply(folders,function(folder){ 
  CreateSeuratObject(counts = Read10X(folder), 
                     project = folder )
})
# 此时的sceList仅仅是一个堆砌了8个10X对象的集合，下一步就要真正合并起来
> sceList
[[1]]
An object of class Seurat 
27998 features across 2915 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (27998 features)

[[2]]
An object of class Seurat 
27998 features across 3106 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (27998 features)

第四步：组合

sce.big <- merge(sceList[[1]], 
                 y = c(sceList[[2]],sceList[[3]],sceList[[4]],
                       sceList[[5]],sceList[[6]],
                       sceList[[7]],sceList[[8]]), 
                 add.cell.ids = folders, 
                 project = "mouse8")

> table(sce.big$orig.ident)
 G_1  G_2  L_1  L_2 NP_1 NP_2 PI_1 PI_2 
2915 3106 5906 3697 2249 2127 1500 4306 

save(sce.big,file = 'sce.big.merge.mouse8.Rdata') # 保存的数据是1.4G

补充

官网的merge教程在：https://satijalab.org/seurat/v3.1/merge_vignette.html

描述了三种情况

第一种：merge两个seurat对象（原始数据）

需要注意的是，组合数据时需要注明每个数据的名称，使用add.cell.ids参数指定

pbmc.combined <- merge(pbmc4k, y = pbmc8k, add.cell.ids = c("4K", "8K"), project = "PBMC12K")
pbmc.combined
## An object of class Seurat 
## 33694 features across 12721 samples within 1 assay 
## Active assay: RNA (33694 features)

# 之后的组合数据就会出现列名的标识
head(colnames(pbmc.combined))
## [1] "4K_AAACCTGAGAAGGCCT" "4K_AAACCTGAGACAGACC" "4K_AAACCTGAGATAGTCA"
## [4] "4K_AAACCTGAGCGCCTCA" "4K_AAACCTGAGGCATGGT" "4K_AAACCTGCAAGGTTCT"
table(pbmc.combined$orig.ident)
## 
## PBMC4K PBMC8K 
##   4340   8381

第二种：merge两个以上（原始数据）

将参数y 设成一个向量，就可以指定其他的数据

pbmc.big <- merge(pbmc3k, 
                  y = c(pbmc4k, pbmc8k), 
                  add.cell.ids = c("3K", "4K", "8K"), 
                  project = "PBMC15K")
unique(sapply(X = strsplit(colnames(pbmc.big), split = "_"), FUN = "[", 1))
## [1] "3K" "4K" "8K"
table(pbmc.big$orig.ident)
## 
## pbmc3k PBMC4K PBMC8K 
##   2638   4340   8381

第三种：merge归一化、标准化数据

默认情况，只会组合原始数据，但如果有的数据时标准化之后的呢？

其实可以通过一个参数merge.data = TRUE指定

pbmc4k <- NormalizeData(pbmc4k)
pbmc8k <- NormalizeData(pbmc8k)
pbmc.normalized <- merge(pbmc4k, 
                         y = pbmc8k, 
                         add.cell.ids = c("4K", "8K"), 
                         project = "PBMC12K", 
                         merge.data = TRUE)

看看第一种组合raw data和第三种组合normalized data对比：

#################
# raw data
#################
GetAssayData(pbmc.combined)[1:10, 1:15]
## 10 x 15 sparse Matrix of class "dgCMatrix"
##                                            
## RP11-34P13.3  . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A       . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5         . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7  . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8  . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.9  . . . . . . . . . . . . . . .
## FO538757.3    . . . . . . . . . . . . . . .
## FO538757.2    . . . . . . . . . 1 . . . . .
## AP006222.2    . . . . . . . . . . . 1 . . .

#################
# normalized data
#################
GetAssayData(pbmc.normalized)[1:10, 1:15]
## 10 x 15 sparse Matrix of class "dgCMatrix"
##                                                           
## RP11-34P13.3  . . . . . . . . . .         . .        . . .
## FAM138A       . . . . . . . . . .         . .        . . .
## OR4F5         . . . . . . . . . .         . .        . . .
## RP11-34P13.7  . . . . . . . . . .         . .        . . .
## RP11-34P13.8  . . . . . . . . . .         . .        . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . .         . .        . . .
## RP11-34P13.9  . . . . . . . . . .         . .        . . .
## FO538757.3    . . . . . . . . . .         . .        . . .
## FO538757.2    . . . . . . . . . 0.7721503 . .        . . .
## AP006222.2    . . . . . . . . . .         . 1.087928 . . .

---

上面的组合多个数据就结束了，接下来是检查组合后的分群结果

首先检查原样本分群结果

# 归一化+标准化（移除了不想要的差异来源nCount_RNA）
sce.big <- NormalizeData(sce.big)
sce.big <- ScaleData(sce.big, vars.to.regress = c('nCount_RNA'),
                     model.use = 'linear', use.umi = FALSE)
# 默认选2000个HVGs
sce.big <- FindVariableFeatures(object = sce.big, 
                              mean.function = ExpMean, 
                              dispersion.function = LogVMR, 
                              mean.cutoff = c(0.0125,4), 
                              dispersion.cutoff = c(0.5,Inf))
# 降维（PCA+tSNE）
sce.big <- RunPCA(object = sce.big, pc.genes = VariableFeatures(sce.big))
sce.big <- RunTSNE(object = sce.big, dims.use = 1:10)
DimPlot(object = sce.big, reduction = "tsne")
# 当然也有ICA的选择 
# sce.big <- RunICA(sce.big )

然后鉴定亚群，看看它们的分群结果

ElbowPlot(sce.big)
# 官方建议，下游分析时可以多用几个PCs试试
sce.big <- FindNeighbors(sce.big, dims = 1:20)
# 保持和原文一样的15个亚群
sce.big <- FindClusters(sce.big, resolution = 0.23)
head(Idents(sce.big), 5)
# 新的亚群结果
DimPlot(object = sce.big, reduction = "tsne",
        group.by = 'RNA_snn_res.0.23')
# 原样本分群结果
DimPlot(object = sce.big, reduction = "tsne",
        group.by = 'orig.ident')

table(sce.big$orig.ident,[e-mail]$RNA_snn_res.0.23)

看到，NP有三个主群、G有三个主群、L有三个主群、PI有两个主群

对比原文的数据

它得到了3个NP、3个G、2个L、3个PI，其余的分给了Basal 4群

---

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